产品货号:
ALH270
中文名称:
一步法RT-PCR试剂盒
英文名称:
LabScript One-Step RT-PCR Kit
产品规格:
125T|250T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验配制的,能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录反应和PCR扩增反应。反应过程中无需打开管盖添加试剂,避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。
本试剂盒包括最佳配比优化的One-Step Enzyme Mix(包含LabScript M-MuLV逆转录酶、热启动Taq DNA聚合酶和RNasin抑制剂),同时包含适用于逆转录和PCR扩增的独特2×RT-PCR Mix反应体系。本制品使用的LabScript M-MuLV逆转录酶缺失了RNase H活性,与普通M-MuLV相比,具有更强的延伸能力和稳定性,可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。同时该LabScript M-MuLV提高了耐热性,可以在42~50℃反转录,提高了复杂二级结构,GC含量丰富模板反转录效率。
适用于高拷贝、低拷贝基因检测;部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。
组分 | 125T | 250T |
2×RT-PCR Mix | 1.25mL | 2×1.25mL |
25×LabScript One-Step Enzyme Mix | 100μL | 200μL |
RNase-free H2O | 1.5mL | 1.5mL |
保存:-20℃,有效期1年。
- 实验过程中应注意避免RNase污染。
- 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板
- 不同的片段,所需最佳RNA模板用量不同,过多的RNA会抑制反应,建议根据反应调整模板用量。
- 不能使用Oligo(dT)和Random Primer合成cDNA。
2×RT-PCR Mix使用前充分融解颠倒混匀(避免剧烈涡旋产生大量气泡)。短期频繁使用可放4℃冰箱。
- 根据下表于冰上配制反应体系:
成分 用量 终浓度 2×RT-PCR Mix 10μL 1× Forward Primer(10μM) 0.4μL 0.2μM Reverse Primer(10μM) 0.4μL 0.2μM 25×LabScript One-Step Enzyme Mix 0.8μL 1× RNA模板 X μL 1pg~1μg RNase-free H2O 至20μL - - 引物浓度请以终浓度0.2~0.6μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。如果同进行多个反应,先按比例配成混合液,振荡混匀后,按每管20-Xμl (X为模板量)分装。
- PCR扩增:
- 将配制好的反应体系混匀、离心后。
- 将热循环仪预热到42℃,将PCR管置于热循环仪中。
- 按以下反应条件进行扩增程序:
过程 温度 时间 循环数 反转录 42℃ 30min 1 预变性 94℃ 2~3min 1 变性 94℃ 30s 30~40 退火 50~60℃ 30s 延伸 72℃ 1~2kb/min 终延伸 72℃ 5~10min 1 保温 4℃ - - 可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少,扩增量不足;循环次数多,错配机率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率的前提下,应尽量减少循环次数。
- 将配制好的反应体系混匀、离心后。
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