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本试剂盒是专为一步法RT-PCR实验配制的，使用该试剂盒能够方便快捷的在同一个反应管内完成逆转录反应和PCR扩增反应。反应过程中无需打开管盖添加试剂，避免了污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。本试剂盒包括最佳配比优化的One-Step Enzyme Mix（包含突变改造LabScript M-MuLV RTase、热启动Taq DNA聚合酶和RNasin），同时包含适用于逆转录和PCR扩增的独特2×RT-PCR Mix反应体系。LabScript M-MuLV反转录酶的RNase H活性缺失，与M-MuLV相比，具有更强的延伸能力和稳定性，可用于较长的cDNA合成以及高比例的全长cDNA文库的构建等。同时该酶提高了耐热性，可以在42～50℃反转录，提高了复杂二级结构，GC含量丰富模板反转录效率。

适用范围：

• 适用于高拷贝、低拷贝基因检测；
  
• 部分高GC含量或具有复杂二级结构的RNA模板。

试剂盒组成：

组分	50μL×50次	50μL×100次
2×RT-PCR Mix	1.25mL	2×1.25mL
One-Step Enzyme Mix	100μL	200μL
RNase-free H2O	1.5mL	1.5mL

保存：-20℃保存，有效期6个月

使用方法：

• 建议反应体系：20～50μL：
  
• 2×RT-PCR Mix使用前充分融解颠倒混匀（避免剧烈涡旋产生大量气泡）。短期频繁使用可放4℃冰箱。
  
• 按下表配置20μL反应体系
  

  成分	用量	终浓度
  2×RT-PCR Mix	10μL	1 X
  Forward Primer（10μm）	0.4μL	0.2μM
  Reverse Primer（10μm）	0.4μL	0.2μM
  One-Step Enzyme Mix	0.8μL	-
  RNA template	X μl	1pg-1μg
  RNase-free H2O	至20μL	-

  
  注意：引物浓度请以终浓度0.2～0.6μM作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度，由此优化反应体系。如果同进行多个反应，先按比例配成混合液，振荡混匀后，按每管20-Xμl (X为模板量)分装。
  
• 将配制好的反应体系混匀、离心后。
  
• 将热循环仪预热到42℃，将PCR管置于热循环仪中，按以下反应条件进行反应。
  
• 扩增程序：
  

  步骤	温度	时间	循环数
  1	42℃	30分钟	1
  2	94℃	2～3分钟	1
  3	94℃	30秒	30～40
  	50～60℃	30秒
  	72℃	1～2kb/分钟
  4	72℃	5～10分钟	1
  5	4℃	保温

  
  注意：可根据扩增产物的下游应用设定循环数。循环次数太少，扩增量不足；循环次数多，错配机率会增加，非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。
  

注意事项：

• 避免RNase污染。
  
• 为保证反应成功建议使用高质量的RNA模板
  
• 不同的片段，所需最佳RNA模板用量不同，过多的RNA会抑制反应，建议根据反应调整模板用量。
  
• 不能使用Oligo(dT)和Random Primer合成cDNA。

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